根据药典要求，对发酵过程关键节点、纯化样品以及冻干制剂进行以下参数的质量检测：含量及纯度检测、免疫印迹实验、生物学活性测定、外源DNA残余量检测、宿主菌蛋白质残留量检测、细菌内毒素检测、紫外光谱检测，检测方法采用药典标准方法。

重组人干扰素-α2b纯化样品的外源DNA残余量检测

【实验目的】

1.掌握外源DNA残余量检测的原理及方法。

【实验原理】

生物制剂是制药行业中发展最快的领域，2014年全球十大畅销药中7个是生物制剂。这些销售上的重磅炸弹在临床上疗效确切，但研发成本高，生产和质量控制要求非常严格。绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。

生物制品中宿主残余DNA既是是生产中带来的杂质，还存在一定安全隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许生物制剂中存在100pg/剂量以下的残留DNA。根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量。

本实验采用PicoGreen® dsDNA定量分析，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25 pg/mL的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。

【实验器材】

1.主要仪器

荧光分光光度计

2.主要试剂

重组人干扰素-α2b纯化样品；

外源DNA残余量检测试剂盒（Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits, invitrogen P7589）。

【实验步骤】

1.先将样品DNA稀释到100 ng/mL，每组250μL。用工作浓度的TE（10 mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH 7.5）将DNA稀释到0、1、2.5、5、10、15、20、25 、50ng/mL的浓度。

2.分别加各浓度样品和待检样品100μL于荧光96孔板中，设立两组平行实验。

3.避光条件下加工作浓度的Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent 100 μL，避光反应3~5 min。

4.荧光酶标仪下，激发光为480 nm，接收光为520 nm下检测吸光值。

5.记录与分析。

【思考题】

1.简述其它用于检测外源DNA残余量的方法，并分析其优劣。

 

重组人干扰素-α2b纯化样品的宿主菌蛋白质残留量检测

【实验目的】

1.掌握酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组人干扰素-α2b中残留菌体蛋白含量的原理及方法。

【实验原理】

宿主细胞蛋白（Host cell protein，HCP）是指病毒性疫苗和基因工程药物中来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。因此，定量测定病毒性疫苗和基因工程药物中残留的HCP是质量控制的一种重要手段，有助于保持纯化工艺的有效性和一致性。

本实验采用Cygnus公司生产的大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒来检测重组人干扰素-α2b纯化样品的宿主菌蛋白质残留。该方法是一个双位点酶联免疫检测。样本中包含的HCP蛋白与标记有抗-E. coli 抗体的辣根过氧化物酶同时反应，反应发生在之前涂有一层吸附性抗-E. coli 蛋白抗体的微量滴定板中进行。免疫反应构成为夹层式结构：固相抗休-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗微量滴定板去除未结合反应物。添加TMB作用底物反应。微量滴定板读数器上测定水解物浓度，水解物浓度与E. coli HCPs蛋白浓度成比例。用标准液绘制标准曲线，根据读数可以计算出E. coli HCPs蛋白含量。

【实验器材】

1.主要仪器

酶标仪

2.主要试剂

重组人干扰素-α2b纯化样品；

大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒（Cygnus，F410）。

【实验步骤】

1.取出所有试剂平衡到室温；

2.分别移取25μL大肠杆菌宿主细胞ELISA检测试剂盒标准液、对照物和样品至待测孔；

3.移取100μL anti-E. coli:HRP至每孔；

4.密封滴定板，摇床室温温育90分钟，180rpm；

5.清空小孔，用纸吸干残留液，350μL清洗缓冲液清洗4次；

6.加100μL TMB 作用物，室温静置30分钟，不需摇床；

7.加100μL反应终止液，于酶标仪450/650nm检测吸光值；

8.记录与分析。

【思考题】

1.基因工程药物中HCP对药物的安全性和有效性有哪些方面的影响？

 

实验五十三 重组人干扰素-α2b纯化样品的细菌内毒素检测

【实验目的】

1.掌握显色基质鲎试剂盒快速凝胶法检测重组人干扰素-α2b纯化样品内毒素残留的原理及方法。

【实验原理】

细菌内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素主要具有以下生物活性：1、致热性。2、致死性毒性。3、白细胞减少。4、Shwartzman反应。5、降低血压，休克6、激活凝血系统。7、诱导对内毒素的耐受性。8、鲎细胞溶解物（鲎试剂）的凝集。9、刺激淋巴细胞有丝分裂。10、诱导抗感染的特异性抵抗力。11、肿瘤细胞坏死作用。内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。

鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405 nm）。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545 nm），避免了供试品本身的颜色对405 nm处吸收峰的干扰。

【实验器材】

1.主要仪器

无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。恒温水浴锅、分光光度计。

2.主要试剂

重组人干扰素-α2b纯化样品；显色基质鲎试剂盒：鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2、偶氮化试剂3、HCl ( 反应终止剂) 、4、细菌内毒素检查用水。

【实验步骤】

1.供试品pH值调至6-8（0.5M NaOH）;

2.细菌内毒素标准溶液配制

标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01，0.025，0.05，0.1 EU/mL或0.1， 0.25，0.5，1.0 EU/mL。稀释方法如下（以0.1，0.25，0.5，1.0 EU/mL为例）：取细菌内毒素工作品1支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1，0.25，0.5，1.0 EU/mL的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。

3.阴性对照为细菌内毒素检查用水。

4.鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解

鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解，注意不要用旋涡混匀仪激烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。

显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4  ℃贮存8小时以内。

偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中；

偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中；

偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中；

偶氮化试剂溶液可于4 ℃贮存1周。

5.检测

取无热原试管，加入100μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。再加入100 μL鲎试剂溶液，混匀，37 ℃温育T1分钟。温育结束，加入100 μL显色基质溶液，混匀，37 ℃温育T2分钟。温育结束，加入500 μL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀加入500 μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545 nm波长处读取吸光度值。

6.数据处理与分析

【思考题】

1.对药品进行细菌内毒素检验的意义是什么？

 

重组人干扰素-α2b纯化样品的紫外光谱检测

【实验目的】

1.掌握运用紫外光谱仪检测重组人干扰素-α2b纯化样品的原理及方法。

【实验原理】

紫外光谱检测是利用物质对不同波长光的选择吸收现象来进行物质的定性和定量分析，通过对吸收光谱的分析，判断物质的结构及化学组成。主要用于化合物的鉴定、纯度检查、异构物的确定、位阻作用的测定、氢键强度的测定以及其他相关的定量分析之中，但通常只是一种辅助分析手段，还需借助其他分析方法，例如红外、核磁、EPR等综合方法对待测物进行分析，以得到精准的数据。

中国药典规定，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描，重组人干扰素-α2b最大吸收峰波长应为27nm±nm。

【实验器材】

1.主要仪器

紫外光谱仪

2.主要试剂

重组人干扰素-α2b纯化样品

超纯水

【实验步骤】

1.将样品浓度用水稀释到300 μg/mL的浓度。

2.以水为参比样，光路为1 cm下，利用紫外可见光谱仪，在波长250 nm~360 nm下扫描检测吸光度，判断最大吸收峰波长。

【思考题】

1.紫外光谱仪的工作原理是什么？

2.紫外光谱在生产和科研中还有哪些方面的应用？